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    聚乙烯亞胺PEI-Pro(GMP)

    簡(jiǎn)(jiǎn)要描述:BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP級別轉染試劑。

    • 產(chǎn)(chǎn)品型號:78EF10003
    • 廠(chǎng)(chǎng)商性質(zhì)(zhì):經(jīng)(jīng)銷(xiāo)(xiāo)商
    • 更新時(shí)(shí)間:2023-11-30
    • 訪(fǎng)(fǎng)  問(wèn)(wèn)  量:1678

    詳細介紹

    品牌BIOHUB供貨周期兩周
    應用領(lǐng)(lǐng)域生物產(chǎn)(chǎn)業(yè)(yè)

    BIOHUB Polyethyleneimine PEI PRO(GMP)是GMP級別轉染試劑,本制品利用BIOHUB公司生產(chǎn)(chǎn)的線(xiàn)(xiàn)性陽(yáng)(yáng)離子聚合物,按照符合GMP認證管理體系下,采用藥用規格原輔料生產(chǎn)(chǎn),所用起始材料及所需化學(xué)(xué)品和配制過(guò)(guò)程均在無(wú)(wú)菌環(huán)(huán)境中操作進(jìn)(jìn)行,以確保制造過(guò)(guò)程中每個(gè)(gè)步驟的特性、效力、純度和安全性的一致性 。并嚴格控制重金屬殘留、細菌內毒素殘留等,生產(chǎn)(chǎn)工藝符合 GMP 規范的產(chǎn)(chǎn)品生產(chǎn)(chǎn)與質(zhì)(zhì)量管理規程,保障生產(chǎn)(chǎn)過(guò)(guò)程及所有原輔料可追溯。

    • PH值檢測通過(guò)(guò)中國藥典 2020 版第四部 pH 值測定法(通則 0631)

    • 檢測遵循《人用基因治療總論-中國藥典 2020》國家藥典委。

    • 檢測遵循USP Chapter <1043>, Ancillary Materials for Cell, Gene, and Tissue-Engineered Products 用于細胞治療,基因治療和組織工程產(chǎn)(chǎn)品中的輔料。

    • 細菌內毒素檢測符合中國藥典2015版四部通則(1143)方法2光度測試法(動(dòng)(dòng)態(tài)(tài)濁度法)

    • 重金屬殘留檢測符合國藥典 2020 版第四部重金屬檢查法(通則 0821)

    • 支原體檢測 使用支原體檢測試劑盒

    質(zhì)(zhì)量信息表

     

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    產(chǎn)(chǎn)品特點(diǎn)(diǎn)
            BIOHUB-PRO GMP在 HEK293和CHO大多數表達系統中,BIOHUB-PRO GMP 都能提供穩定的高表 達(96 孔板至 100L 生物反應器)?,F在每年有更多的研究人員和公司選擇使用 BIOHUB-PRO GMP 進(jìn)(jìn)行細胞轉染.。
    • GMP級別定制監管,支持并滿(mǎn)(mǎn)足合規要求。

    • 不含動(dòng)(dòng)物源性成分。

    • 嚴格遵循以下規范生產(chǎn)(chǎn) 1. ISO 9001:2015, certified facility。

    • 嚴格按照《GMP 附錄-細胞治療產(chǎn)(chǎn)品》國家藥品監督管理局。

    • 從工藝開(kāi)(kāi)發(fā)(fā)到臨床試驗和商業(yè)(yè)化的無(wú)(wú)縫過(guò)(guò)渡生產(chǎn)(chǎn)細胞系(HEK-293 和衍生物、VERO 等的最高病毒產(chǎn)(chǎn)量。

    操作方法參考

     

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     一、貼壁細胞轉染 以 6 孔板轉染 293T 細胞為例:(一)轉染前準備1) 轉染前一天:用膠原酶 I型(78CL10002)消化細胞并計數(不建議用yi酶)。 按照每孔2×10 6的細胞量接種293T 至 6 孔板(每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5?S wan全培養基和 1ml 的細胞懸液)置于 37°C,5%CO2培養 箱培養 24h。2) 24h 后,移除之前培養基,每孔加入 2ml 新鮮的 DMEM:F12+5?S。注意:確保 293T 細胞生長(cháng)(cháng)狀態(tài)(tài)良好傳代 不超過(guò)(guò) 15 代。(二)轉染過(guò)(guò)程3) 第一天:顯微鏡下檢查細胞匯合度, 當細胞達到 70%到 80%的匯合度時(shí)(shí),開(kāi)(kāi)始準備轉染。4) 對于每孔細胞,用 100µl 無(wú)(wú)血清培養基(如 OPTI-MEMⅠ培養基)稀釋 DNA 使 DNA 終濃 度為 1ug/ml(DNA/總培養體積)。5) 對于每孔細胞,用 100μL 無(wú)(wú)血清培養基(如 OPTI-MEMⅠ培養基)稀釋適當比例的適量 BIOHUB-PRO GMP 。DNA:BIOHUB-PRO GMP  的比例要依據自己實(shí)(shí)驗摸索最適比例。6) 將稀釋的 BIOHUB-PRO  GMP轉染試劑加入到稀釋的質(zhì)(zhì)粒中(總體積 200µL)輕輕混勻, 室溫孵育 30 分鐘。7) 小心地將 BIOHUB-PRO  GMP復合物滴加到細胞培養板每個(gè)(gè)孔中,輕輕搖動(dòng)(dòng)培養板混勻。注 意加入混合液時(shí)(shí)輕輕沿著(zhù)(zhù)孔板邊緣滴入,而不是在細胞的頂部以免破壞細胞的粘附性。8) 將培養板放入 37°C,5%CO2培養箱培養中培養 24h。(三)觀(guān)(guān)察轉染結果 9) 第二天:在熒光顯微鏡下觀(guān)(guān)察細胞轉染效率,通常超過(guò)(guò) 80%的 293T 細胞在轉染后的 24h 可以觀(guān)(guān)察到綠色熒光。 小貼士 :建議進(jìn)(jìn)行不同基因轉染時(shí)(shí)應對 BIOHUB-PRO GMP 和 DNA 的比例進(jìn)(jìn)行優(yōu)(yōu)化,以達到最適比例, 通常篩選范圍在 1:1 到 1:3 之間。如果之前用過(guò)(guò)進(jìn)(jìn)口品牌的 PEI,用BIOHUB-PRO  GMP時(shí)(shí)應適當 降低使用濃度。      通常情況下,分別準備BIOHUB-PRO GMP  GMP和 DNA 轉染溶液時(shí)(shí)其體積一般是轉染前每孔細胞培 養液體積總量的 1/10-1/20,如細胞培養液體積為 3ml,則稀釋BIOHUB-PRO  GMPI及 DNA 的體積為150ul。質(zhì)(zhì)粒 DNA 的濃度通常為 1ug/ml(DNA 質(zhì)(zhì)量/細胞培養總體積)[1][4]。 不同質(zhì)(zhì)粒種類(lèi)(lèi)以及大小會(huì )(huì )影響轉染效率,如較大片段插入質(zhì)(zhì)??贍苻D染效率低,可根據 實(shí)(shí)際實(shí)(shí)驗需要調整,如適當增加轉染質(zhì)(zhì)??偭康?。 ?HEK293 GnTI 細胞重懸浮可用槍頭或移液管反復吹打,但 CHO-S 細胞的粘附性比較強 重懸浮時(shí)(shí)需要借助細胞刮刀。 一般建議用膠原酶消化細胞,如果表達的是膜蛋白,yi酶消化細胞可能會(huì )(huì )降低蛋白表達, 建議用膠原酶消化細胞,我們推薦用(78CL10002)的膠原酶。 對于貼壁性低的細胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細胞與培養皿之間的粘附性。 一旦確定了細胞類(lèi)(lèi)型、培養基和78BioPEI GMP與 DNA 的最佳比例,就可以在轉染后 24 至 96 小時(shí)(shí)內多次觀(guān)(guān)察轉染效率,以?xún)?yōu)化最大表達量時(shí)(shí)間點(diǎn)(diǎn)。二、懸浮細胞轉染 離心對數期生長(cháng)(cháng)的細胞用新鮮的培養基重懸浮使細胞密度達到 1×10 6cells/mL 小規模轉 染時(shí)(shí),如需大規模轉染細胞密度要到達 2-3×10 6cellsml/mL。以 293F 細胞 于 100mL 培養瓶(溶液體積占瓶體積的 1/5)操作體系舉例如下:(一)轉染前準備 1) HEK293F 細胞傳代接種于 20mL 懸浮細胞生長(cháng)(cháng)培養基中(36.5℃,120rpm,5%CO2 )的條 件下培養。當細胞密度到 1X10 6cells/mL,然后旋緊瓶口放入搖床繼續培養,2~4 小時(shí)(shí) 后可以進(jìn)(jìn)行轉染。(二)轉染過(guò)(guò)程 2) 用 1mlOptiPRO™SFM(無(wú)(wú)血清培養基)稀釋適量的 DNA,使 DNA 終濃度為 1ug/ml(DNA/總 培養體積)?;靹蠆㈧o置 5min。 3) 用1mlOptiPRO™SFM(無(wú)(wú)血清培養基)稀釋適當比例的BIOHUB-PRO  GMP,混勻并靜置 10min。(78BioPEI:DNA 參考比例范圍,可參考上述貼壁細胞BIOHUB-PRO  GMP和 DNA 優(yōu)(yōu)化方案優(yōu)(yōu)化)。 4) 將BIOHUB-PRO  GMP轉染試劑加入到稀釋的質(zhì)(zhì)粒中輕輕混勻,室溫孵育 30 分鐘。 5) 將BIOHUB-PRO  GMP轉染復合物逐滴加入到細胞培養液中,搖勻后旋緊瓶口放回搖床 (36.5℃,5%CO2,120rpm)。 6) 基因表達可在 24-72 小時(shí)(shí)后檢測,具體時(shí)(shí)間取決于細胞系和轉基因. 小貼士:在懸浮培養中,單個(gè)(gè)細胞的轉染效率要高于聚集在一起的細胞,需要優(yōu)(yōu)化適合單細胞的 生長(cháng)(cháng)條件。方形瓶應經(jīng)(jīng)過(guò)(guò)兩個(gè)(gè)連續的干燥循環(huán)(huán)高壓滅菌(每個(gè)(gè) 45 分鐘,干燥 15 分鐘) 蓋子應盡可能松,不得脫落。應該讓它們冷卻擰緊蓋子前,將其wan全放入層流罩中。如果瓶子向內塌陷,細胞將無(wú)(wú)法正常生長(cháng)(cháng)。 如果要獲得更多的蛋白產(chǎn)(chǎn)量,有參考文獻表明轉染后 24 小時(shí)(shí),可以適當稀釋細胞,稀 釋比例參考范圍(1:2—1:5)之間,可以增加蛋白產(chǎn)(chǎn)量,稀釋效應與最佳稀釋比率應根 據經(jīng)(jīng)驗確定, 可以把 DNA 和BIOHUB-PRO  GMP 轉染試劑直接加入到細胞懸液中進(jìn)(jìn)行轉染,但必須經(jīng)(jīng)過(guò)(guò)上述 特定流程的 DNA 和轉染試劑的比例和用量的相應優(yōu)(yōu)化。

    注意事項

    1. 不同質(zhì)(zhì)粒種類(lèi)(lèi)以及大小會(huì )(huì )影響轉染效率,可如較大片段插入質(zhì)(zhì)??贍苻D染效率低,可根據實(shí)(shí)際實(shí)(shí)驗需要調整,如適當增加轉染質(zhì)(zhì)??偭康?。

    2. 細胞狀態(tài)(tài)及代數會(huì )(huì )較大程度影響轉染。剛復蘇細胞需傳代2-3次以上,待細胞生長(cháng)(cháng)穩定后做轉染實(shí)(shí)驗。為保證實(shí)(shí)驗穩定性,轉染細胞盡量選擇20代以?xún)冗M(jìn)(jìn)行實(shí)(shí)驗。

    3. 對于貼壁性低的細胞系,可用明膠或鼠尾膠鋪板,增加細胞與培養皿之間的粘附性。

    4. 初次使用應優(yōu)(yōu)化DNA濃度和 BIOHUB-PRO GMP試劑量以得到最大的轉染效率。 DNA 和轉染試劑的比例, 通常推薦是1:2-1:3,通過(guò)(guò)調整DNA/BIOHUB-PRO  GMP轉染試劑比例優(yōu)(yōu)化轉染效率,調整范圍DNAμg:BIOHUB-PRO  GMP(μL) 比值在1:0.5-1:5。

    5.  為了您的安全和健康,請穿實(shí)(shí)驗服并戴一次性手套操作。

     

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