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    G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳霉素

    簡(jiǎn)(jiǎn)要描述:G418 Sulfate(G418硫酸鹽),也稱(chēng)(chēng)作Geneticin(遺傳霉素),是一種結構類(lèi)(lèi)似于慶大mei素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷類(lèi)(lèi)抗生素,G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳霉素通過(guò)(guò)影響80S核糖體功能和阻斷延伸步驟來(lái)(lái)干擾蛋白合成,對原核和真核等細胞都有毒性,包括細菌、酵母、高等植物和哺乳動(dòng)(dòng)物細胞,也包括原生動(dòng)(dòng)物和蠕蟲(chóng)(chóng)。

    • 產(chǎn)(chǎn)品型號:78GA10001
    • 廠(chǎng)(chǎng)商性質(zhì)(zhì):經(jīng)(jīng)銷(xiāo)(xiāo)商
    • 更新時(shí)(shí)間:2023-11-30
    • 訪(fǎng)(fǎng)  問(wèn)(wèn)  量:1886

    詳細介紹

    品牌BIOHUB供貨周期兩周
    應用領(lǐng)(lǐng)域生物產(chǎn)(chǎn)業(yè)(yè)

    G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳霉素

    基本信息CAS號  108321-42-2

    分子式  C20H40N4O10·2 H2SO4

    分子量  692.7 g/mol

    外觀(guān)(guān)  白色粉末

    純度  ~98%

    活力溶解性  >700 μg/mg 溶于水

    產(chǎn)(chǎn)品簡(jiǎn)(jiǎn)介

           G418 Sulfate(G418硫酸鹽),也稱(chēng)(chēng)作Geneticin(遺傳霉素),是一種結構類(lèi)(lèi)似于慶大mei素B1(Gentamycin B1)的氨基糖苷類(lèi)(lèi)抗生素,G418 Sulfate(Geneticin) 遺傳霉素通過(guò)(guò)影響80S核糖體功能和阻斷延伸步驟來(lái)(lái)干擾蛋白合成,對原核和真核等細胞都有毒性,包括細菌、酵母、高等植物和哺乳動(dòng)(dòng)物細胞,也包括原生動(dòng)(dòng)物和蠕蟲(chóng)(chóng)。其抗性基因(主要為neo基因)位于轉座子Tn601(903)或Tn5(來(lái)(lái)源于細菌),但是可以在真核細胞中表達。通過(guò)(guò)基因重組技術(shù)(shù)將這些抗性基因導入細胞,使其獲得對G418的耐藥性,從而用來(lái)(lái)篩選和維持培養攜帶抗性基因的原核或者真核細胞。 哺乳動(dòng)(dòng)物細胞中,當抗性基因neo被整合進(jìn)(jìn)真核細胞基因組后,使其編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶(amino-glycoside 3’-phosphotransferase,APH(3')II)。此酶通過(guò)(guò)共價(jià)(jià)修飾G418的氨基或羥基功能,抑制抗生素-核糖體間的相互作用,從而使得抗生素失活。這一特性賦予細胞產(chǎn)(chǎn)生抗性。穩轉細胞株篩選實(shí)(shí)驗,需要建立殺滅曲線(xiàn)(xiàn)(劑量反應曲線(xiàn)(xiàn))確定殺死無(wú)(wú)抗性細胞的zui低有效濃度。 植物細胞中,通過(guò)(guò)轉染攜帶nptII基因的抗性質(zhì)(zhì)粒孵育其抗性。nptII基因也能編碼表達氨基糖苷磷酸轉移酶,這個(gè)(gè)酶使得多種抗生素喪失活性,包括G418,卡那mei素和巴龍mei素。

    使用說(shuō)(shuō)明

    1. G418儲存液的配制(50 mg/mL,活性濃度)

       (1)活力單位的換算

    根據此公式進(jìn)(jìn)行換算:(1000/A0)×A1=A2,其中A0是G418的活力值(Potency),因批次而異??梢?jiàn)批次對應的質(zhì)(zhì)檢報告,或者瓶子上的標簽。A1是想配制的活性G418濃度。A2是實(shí)(shí)際稱(chēng)(chēng)重的粉末與體積比濃度。

    比如若所用批次的G418 活力值為:750 µg/mg,要配制50 mg/mL的G418活性濃度,則實(shí)(shí)際要配制的粉末濃度為1000/750×50 mg/mL=66.33 mg/mL。

    如果配制10 mL的G418儲存液(活性濃度,50 mg/mL),則需要稱(chēng)(chēng)取663.3 mg粉末。

    (2)除菌和保存

    根據上述換算得到的實(shí)(shí)際粉末稱(chēng)(chēng)重量,加入10 mL無(wú)(wú)菌去離子水內使其wan全溶解。

    先用5 mL無(wú)(wú)菌去離子水預濕潤0.22 μm針頭式過(guò)(guò)濾器,除盡水。之后使用此濾器過(guò)(guò)濾,除菌后分裝成單次使用的小量(如1mL)放到-20℃凍存,1年穩定。

    【注】

         ①不要對混濁的溶液進(jìn)(jìn)行過(guò)(guò)濾,因為混濁的溶液意味著(zhù)(zhù)未wan全溶解,過(guò)(guò)濾過(guò)(guò)程中會(huì )(huì )造成藥物損失,降低終液的活性。

         ②不建議使用液體培養基,NaCl,磷酸鹽溶液或者有機溶劑來(lái)(lái)制備儲存液。

     

    2. 常用篩選濃度

    一般來(lái)(lái)說(shuō)(shuō),剛開(kāi)(kāi)始篩選轉化子需要高濃度的G418,并用一個(gè)(gè)較低濃度的G418用于維持培養。生長(cháng)(cháng)條件,細胞類(lèi)(lèi)型和其他的環(huán)(huán)境因素都可能影響G418的用量,因此第一次使用的實(shí)(shí)驗體系建議通過(guò)(guò)殺滅曲線(xiàn)(xiàn)(kill curve),即劑量反應性曲線(xiàn)(xiàn),來(lái)(lái)確定最佳篩選濃度。

    通常情況,哺乳動(dòng)(dòng)物細胞篩選范圍200-2000 μg/mL;植物細胞:10-100 μg/mL;酵母細胞:500-1000 μg/mL。

    以下是一些細胞類(lèi)(lèi)型使用G418篩選使用的濃度,可做參考。

     

    細胞類(lèi)(lèi)型

    激活濃度

    應用

    網(wǎng)(wǎng)柄菌屬

    a) 10 μg/mL

    b) 30 μg/mL

    a)培養在培養液中

    b)培養在凍干細菌上

    哺乳動(dòng)(dòng)物

    a) 400 -1000 μg/mL

    b) 200 μg/mL

    a)用于篩選

    b)用于維持生長(cháng)(cháng)

    植物

    a) 25-50 μg/mL

    b) 10 μg/mL

    a)用于篩選

    b)用于維持生長(cháng)(cháng)

    酵母

    a) 500 μg/mL

    b) 125-200 μg/mL

    a)用于篩選

    b)用于維持生長(cháng)(cháng)

    細菌

    16 μg/mL

    用于篩選


















    3. 殺滅曲線(xiàn)(xiàn)的建立

     【注意事項】為了篩選得到穩定表達目的蛋白的細胞株,需要確定能夠殺死未轉染宿主細胞的抗生素zui低濃度,可通過(guò)(guò)建立殺滅曲線(xiàn)(xiàn)來(lái)(lái)實(shí)(shí)現,至少選擇6個(gè)(gè)濃度。處理分裂期的細胞時(shí)(shí)G418的活性zui強,因此在添加G418之前需要讓細胞培養一段時(shí)(shí)間。

    (1)第一天:未轉化的細胞按照20-25%的細胞密度鋪在合適的培養板上,37℃,CO2培養過(guò)(guò)夜。

         【注】對于需要更高密度來(lái)(lái)檢測活力的細胞,可增加接種量。

    (2)根據細胞類(lèi)(lèi)型,設定合適范圍內的濃度梯度。以哺乳動(dòng)(dòng)物細胞為例,可設定0,50,100,200,400,800,1000 μg/mL。

    (3)第二天:去除舊的培養基,換用新鮮配制的含有相應濃度藥物的培養基。每個(gè)(gè)濃度做三個(gè)(gè)平行孔。

    (4)接下來(lái)(lái)每3-4天更換新的含藥物培養基。

    (5)按照固定的周期(如每2天)進(jìn)(jìn)行活細胞計數來(lái)(lái)確定阻止未轉染細胞生長(cháng)(cháng)的恰當濃度。選擇在理想的天數(通常是7-10天)內能夠殺死絕大多數細胞的zui低濃度為穩定轉染細胞篩選用的工作濃度。

     

    4. 穩定轉染細胞的篩選

          (1)轉染48 h后,用含有適當濃度的G418篩選培養基來(lái)(lái)傳代細胞(直接傳代或者稀釋后傳代)。

        【注】細胞處于活躍分裂狀態(tài)(tài)時(shí)(shí)抗生素的殺傷效果好。當細胞過(guò)(guò)于稠密,其效率會(huì )(huì )降低。為了得到較好的篩選效果,請最好將細胞稀釋至豐度不超過(guò)(guò)25%。

    (2)每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養液。

    (3)篩選7天后觀(guān)(guān)察并評估細胞克?。洌┑男緯汕闆r。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)(shí)間,這取決于宿主細胞類(lèi)(lèi)型,轉染以及篩選效果。

    (4)挑取并轉移5-10個(gè)(gè)抗性克隆于35 mm細胞培養板,繼續用含藥物的篩選培養液維持培養7天。

    (5)之后更換正常培養基培養即可。

    運輸與保存方法

    常溫運輸。-20℃避光保存,有效期3年。避免受潮,否則會(huì )(huì )降低抗生素活力。

    注意事項

    (1)本品不可高壓滅菌;

    (2)G418不要和其他的抗生素/抗真菌劑(如青mei素/鏈mei素)共同使用,因為它們是G418的競爭性抑制劑。其他的抗生素也會(huì )(huì )產(chǎn)(chǎn)生交叉活性。

    (3)配制G418溶液時(shí)(shí),一定要根據G418批次不同的活力值(potency)來(lái)(lái)進(jìn)(jìn)行換算,從而得到需要活性濃度的儲存液及工作液。

    (4)G418加入培養體系中未轉染的細胞有可能不會(huì )(huì )被殺死,原因在于藥物濃度過(guò)(guò)低,或者細胞密度過(guò)(guò)高。另外,快速分裂的細胞相對于緩慢增殖細胞,更容易被殺死。對照細胞(未轉染)可能抗生素添加5-7天后才能殺死,轉染細胞(抗性克隆子)的克隆需要10-14天形成。

    (5)即使加入殺死劑量的G418,細胞可能會(huì )(huì )繼續分裂2-3次。G418的藥效通常在2天后才變得明顯。

    (6)為了您的安全和健康,請穿實(shí)(shí)驗服并戴一次性手套操作。

     

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